荧光定量PCR（Real-time PCR）是一种先进的技术，通过在PCR扩增反应中添加荧光基团，实时检测每个循环中产生的荧光信号，最终利用标准曲线对未知模板进行精准的定量分析。以探针法为例，在PCR扩增过程中，除了加入一对引物外，还需添加特异性的荧光探针。该探针两端分别标记有一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。最初，探针结合在DNA单链上，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，因此不会检测到荧光信号；而在PCR扩增阶段，Taq酶会降解探针，使报告基团与淬灭基团分离，从而释放出可被检测到的荧光信号。每当扩增一条DNA链时，便会形成一个荧光分子，实现荧光信号的积累与PCR产物的同步生成。

传统PCR在检测过程中需要进行染色和电泳分离，且只能实现定性分析，难以做到准确的定量，并可能因污染而导致假阳性结果。因此，这种方法的应用受到限制。然而，荧光定量PCR技术不仅能对模板进行定量分析，还具备高灵敏度、良好的特异性和可靠性、自动化程度高以及无污染等特点，使其逐步取代常规PCR技术。PCR扩增反应的前几个循环中，荧光信号变化不大，呈现接近直线的基线，这个基线可以自动生成或手动设置。随后，反应进入指数增长阶段，扩增曲线表现出高度的重复性。在这个阶段，可以设置荧光阈值线，通常将其设定为3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍。当每个反应管的荧光信号达到设定阈值时，经历的循环数称为CT值（阈值循环数），其值与起始浓度的对数成线性关系，并具有良好的重现性。

CT值的最大的意义在于用于计算目标基因的表达量，相关概念包括绝对定量与相对定量。绝对定量旨在测定样本中目标基因的分子数（即拷贝数），而相对定量则评估目标基因在不同样本间的相对比例，无需了解每个样本的拷贝数。尽管CT值能够用来计算这两种定量结果，绝对定量实验需要已知拷贝数的绝对标准品并制作标准曲线，而相对定量则可以选择是否制作标准曲线。在实验室中，由于绝对标准品的制作困难，一般常选择相对定量方法来计算基因表达量。

自荧光定量PCR问世以来，其在生物科学发展中的作用显著，应用范围十分广泛，如下几个领域：

• 核酸定量分析：可用于传染性疾病的定量和定性分析，检测病原微生物或病毒的含量，例如针对甲型H1N1流感、转基因动植物基因拷贝数及RNAi基因失活率的检测。
• 基因表达差异分析：比较处理后样本中目标基因的表达差异，包括药物、物理、化学处理的影响，以及特定基因在不同时间点的表达对比及cDNA芯片结果的验证。
• SNP检测：针对单核苷酸多态性进行检测，对个体对不同疾病的易感性及药物反应的研究具有重要意义，结合巧妙的分子信标结构，可以实现高通量准确检测。
• 甲基化检测：与多种人类疾病，尤其是癌症相关，通过特异性引物和Taqman探针来区分甲基化与非甲基化DNA，为提高灵敏度提供了便利。
• 产前诊断：通过无创的方式从孕妇外周血中分离胎儿DNA，利用实时荧光定量PCR检测性别相关基因，能有效减少遗传性疾病的发生。
• 病原体检测：通过荧光定量PCR技术可对多种病原体进行快速有效的定量分析，相较传统方法更具灵敏度及便捷性。
• 药物疗效考核：可用于乙型肝炎病毒(HBV)与丙型肝炎病毒(HCV)的定量分析，了解病毒量与疗效之间的关系。
• 肿瘤基因检测：尽管肿瘤发病机制尚不完全清晰，但相关基因的突变被广泛认同为致癌的核心因素，实时荧光定量PCR可以有效检测癌基因的表达情况。

综上所述，利来国际致力于推广更多高效的生物医疗技术，助力科学研究发展，荧光定量PCR作为关键技术之一，正推动着生命科学的前沿研究，满足临床诊断和科研的多种需求。